आईएफए पद्धति का उपयोग करके विश्लेषण। एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा)

एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख, एलिसा, एलिसा (एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख), एंजाइम इम्युनोसॉरबेंट परख (अव्य। किण्व- खट्टा; अव्य. प्रतिरक्षा- मुक्त, किसी चीज़ से मुक्त और सोर्बियो- अवशोषित करना; यूनानी विश्लेषण -अपघटन, विघटन) एक एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट पर आधारित इम्यूनोकेमिकल विश्लेषण की एक अत्यधिक संवेदनशील विधि है, जिसका उपयोग एक जटिल मिश्रण में विशिष्ट एंटीजन निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इस परीक्षण का सबसे आम संस्करण दो एंटीबॉडी तैयारियों का उपयोग करता है: परीक्षण किए जा रहे प्रोटीन के लिए विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी को एक ठोस समर्थन पर अधिशोषित किया जाता है, जिसमें विश्लेषण किए जा रहे नमूने की एक निर्दिष्ट मात्रा जोड़ी जाती है; फिर, एंटीबॉडी-एंटीजन कॉम्प्लेक्स का पता लगाने के लिए, परीक्षण किए जा रहे प्रोटीन के दूसरे क्षेत्र के लिए विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी को जोड़ा जाता है, जो एंजाइम से संयुग्मित होते हैं। एंजाइम एक विशेष सब्सट्रेट के रंग परिवर्तन को उत्प्रेरित करता है अखिरी सहारा, जिसे फोटोमेट्रिकल रूप से रिकॉर्ड किया जाता है। विभिन्न रोगों के निदान के लिए इस परीक्षण का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

इस पद्धति के विभिन्न संशोधनों में एलिसा का उपयोग रक्त, मस्तिष्कमेरु द्रव, बीमार लोगों और जानवरों के अंगों और ऊतकों के साथ-साथ प्रायोगिक सामग्रियों (संक्रमित कोशिका संस्कृतियों, प्रयोगशाला जानवरों के अंगों, आदि) में वायरस-विशिष्ट एंटीजन का पता लगाने के लिए किया जाता है। . एलिसा का उपयोग करके पृथक वायरस की पहचान करना संभव है। वायरल संक्रमण के सीरोलॉजिकल निदान, जनसंख्या की प्रतिरक्षा संरचना का अध्ययन, टीका लगाए गए लोगों में हास्य प्रतिरक्षा की स्थिति का निर्धारण करने और अन्य उद्देश्यों के लिए एलिसा विधियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

यह विधि उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता, दक्षता और कार्यान्वयन की गति की विशेषता है। यदि आवश्यक हो तो प्रतिक्रिया क्षेत्र में की जा सकती है।

एलिसा करने के लिए, निम्नलिखित सामग्रियों की आवश्यकता होती है: विशिष्ट वायरल एंटीजन, सामान्य एंटीजन, मानव एम- और जी-प्रोटीन के इम्युनोग्लोबुलिन, विशिष्ट और सामान्य इम्युनोग्लोबुलिन, रोगियों के सकारात्मक आईजीएम या आईजीजी सकारात्मक सीरा, सामान्य मानव सीरा, ग्लोब्युलिन के पेरोक्सीडेज संयुग्म, कार्बोनेट-बाइकार्बोनेट, फॉस्फेट, साइट्रेट-फॉस्फेट बफर, प्लेटों के कुओं को धोने के लिए समाधान, क्रोमोजेन (टेट्रामिथाइलबेन्ज़िडाइन समाधान), गोजातीय एल्ब्यूमिन समाधान, हाइड्रोजन पेरोक्साइड, सल्फ्यूरिक एसिड. एलिसा प्रतिक्रिया को ध्यान में रखते हुए, 96-वेल पॉलीस्टीरिन प्लेटों में किया जाता है ऑप्टिकल घनत्व 450 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर प्रयोगात्मक और नियंत्रण कुओं में।

विशिष्ट वायरल एंटीजन ("सैंडविच" एलिसा) के निर्धारण के लिए एलिसा। एलिसा में वायरल एंटीजन का पता लगाने का सिद्धांत यह है कि पॉलीस्टाइरीन प्लेटों के कुओं की सतह से जुड़े विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन परीक्षण नमूने से एंटीजन को सोख लेते हैं और एक विशिष्ट संयुग्म के साथ एक प्रतिरक्षा परिसर बनाते हैं, जिसे फिर एक सब्सट्रेट-संकेतक समाधान जोड़कर पता लगाया जाता है। .

यह विधि आपको विशिष्ट एंटीजन की पहचान करने की अनुमति देती है जब जांच की गई सामग्रियों में संक्रामक वायरस सामग्री कम से कम 1.0-2.5 आईजी (एलडी50), या टीसीडी50, या 10-150 पीएफयू हो।

विशिष्ट वर्ग एम इम्युनोग्लोबुलिन (एलिसा-आईजीएम, मैक-एलिसा) का पता लगाने ("कैप्चर") के लिए एलिसा। मनुष्यों और जानवरों के सीरा में वर्ग एम के विशिष्ट एंटीबॉडी का निर्धारण करने का सिद्धांत मानव सीरम के आईजीएम के खिलाफ इम्युनोग्लोबुलिन द्वारा इन एंटीबॉडी को "पकड़ना" है, जो कुओं की सतह पर सोख लिया जाता है, और विशिष्ट एंटीबॉडी के एक प्रतिरक्षा परिसर का निर्माण होता है। एक विशिष्ट एंटीजन और एक संयुग्म, जिसके बाद एक सब्सट्रेट-संकेतक समाधान में इसकी अभिव्यक्ति होती है।

प्रतिक्रिया के पहले चरण में, प्लेटों के कुओं को मानव आईजीएम म्यू श्रृंखला के खिलाफ एंटीबॉडी (आमतौर पर बकरी) के साथ संवेदनशील बनाया जाता है। एलिसा का यह संशोधन रूमेटॉइड कारक की उपस्थिति से जुड़े गलत-सकारात्मक परिणामों से बचाता है। एलिसा-आईजीएम सीरोलॉजिकल रैपिड डायग्नोसिस की एक विधि है, क्योंकि कई तीव्र वायरल संक्रमणों में, रक्त सीरम और मस्तिष्कमेरु द्रव में विशिष्ट आईजीएम एंटीबॉडी रोग के पहले दिनों में ही दिखाई देते हैं, लेकिन अक्सर ठीक होने के 3-5 महीने बाद गायब हो जाते हैं। उनके टाइटर्स कभी-कभी (उदाहरण के लिए, वेस्ट नाइल बुखार और टिक-जनित एन्सेफलाइटिस के साथ) बहुत पहुँच जाते हैं उच्च मूल्य - 1:102400-204800.

एकल सीरा में विशिष्ट आईजीएम का पता लगाना, साथ ही युग्मित सीरा में उनके सीरोरूपांतरण का पता लगाना, आमतौर पर एक तीव्र प्राथमिक संक्रमण की उपस्थिति का संकेत देता है।

विशिष्ट आईजीजी के निर्धारण के लिए एलिसा - अप्रत्यक्ष "सैंडविच" एलिसा (एलिसा-आईजीजी)। इस संशोधन का उद्देश्य बीमार लोगों, स्वास्थ्य लाभ प्राप्त लोगों के रक्त सीरा में विशिष्ट आईजीजी का पता लगाना, आबादी की प्रतिरक्षा संरचना का अध्ययन करना, टीका लगाए गए व्यक्तियों में प्रतिरक्षा संकेतक निर्धारित करना और अन्य उद्देश्य हैं।

एलिसा-आईजीजी के विशिष्ट घटकों को जोड़ने का क्रम है: इम्युनोग्लोबुलिन -> वायरल एंटीजन -> मानव आईजीजी के खिलाफ विषम एंटीबॉडी (ग्लोब्युलिन) का पेरोक्सीडेज संयुग्म।

एलिसा-आईजीजी का उपयोग करके सीरोलॉजिकल डायग्नोस्टिक्स का संचालन करते समय, एंटीबॉडी सेरोकनवर्सन की पहचान करने के लिए युग्मित रोगी सीरा की जांच करना आवश्यक है।

आईजीजी अम्लता निर्धारित करने के लिए एलिसा। आईजीजी एंटीबॉडी की अम्लता निर्धारित करने की विधि इस तथ्य पर आधारित है कि आईजीजी एंटीबॉडी के निर्माण और बीमारी और ठीक होने के दौरान हास्य प्रतिरक्षा के विकास के दौरान, विशिष्ट उच्च-अम्लता एंटीबॉडी का अनुपात बढ़ जाता है। इसलिए, कम-एविटी आईजीजी एंटीबॉडी की उपस्थिति संक्रमण की प्राथमिक प्रकृति को इंगित करती है, जबकि उच्च-एविटी आईजीजी पिछली बीमारी, संक्रमण के पुनर्सक्रियन या पुन: संक्रमण की विशेषता है। यूरिया से उपचारित और अनुपचारित सीरा में एलिसा-आईजीजी द्वारा उनकी गतिविधि के तुलनात्मक निर्धारण से आईजीजी अम्लता की डिग्री का पता चलता है, और इसे अम्लता सूचकांक के रूप में व्यक्त किया जाता है। यह यूरिया-उपचारित सीरम के सिग्नल और अनुपचारित सीरम के सिग्नल के अनुपात को दर्शाता है। 30% से कम अम्लता को कम माना जाता है और इसे एक तीव्र प्राथमिक संक्रमण का संकेत माना जाता है जो भीतर हुआ है पिछला महीनारोग की शुरुआत के बाद. उच्च अम्लता (50% से अधिक) एंटीबॉडी की इतिहास संबंधी प्रकृति को इंगित करती है।

एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परीक्षण प्रणालियों में सुधार के लिए आधुनिक दृष्टिकोण में पुनः संयोजक वायरल प्रोटीन, केंद्रित और शुद्ध एंटीजन (एक सब्सट्रेट के रूप में) और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज के साथ लेबल किए गए एंटीजन के साथ-साथ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और नए ठोस-चरण वाहक का उपयोग शामिल है, जो प्रतिक्रिया समय को घटाकर 15-15 मिनट कर दें। 20 मिनट।

एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख एक विश्वसनीय, किफायती और अत्यधिक संवेदनशील तरीका है। यह मानक तैयारियों, शुद्ध एंटीजन या एक एंजाइम से सहसंयोजक रूप से जुड़े एंटीबॉडी के उपयोग पर आधारित है। ये दवाएं प्रतिरक्षाविज्ञानी गुणों और एंजाइमेटिक गतिविधि दोनों को बरकरार रखती हैं, जिन्हें एंजाइम के लिए एक सब्सट्रेट जोड़कर मापा जा सकता है।

मनुष्यों और जानवरों के वायरल रोगों के निदान में, एंटीजन और एंटीबॉडी के लेबल के रूप में एंजाइमों के उपयोग पर आधारित विधियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। विधियों के इस समूह को एंजाइम इम्यूनोएसे कहा जाता है।

एलिसा का उपयोग दो संस्करणों में किया जाता है: हिस्टोकेमिकल और ठोस चरण।

एलिसा या इम्यूनोपरोक्सीडेज प्रतिक्रिया का हिस्टोकेमिकल संस्करण, शायद ही कभी उपयोग किया जाता है। यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधि के समान है, लेकिन इसमें अंतर है कि प्रतिक्रिया फ्लोरोक्रोम के साथ नहीं, बल्कि एक एंजाइम के साथ लेबल किए गए एंटीबॉडी का उपयोग करके की जाती है।

एंजाइमों का उपयोग आमतौर पर एंटीबॉडी को लेबल करने के लिए किया जाता है: हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज़ (अधिक बार), क्षारीय फॉस्फेटेज़, गैलेक्टोसिडेज़, आदि।

इस प्रकार, एक एंजाइम के साथ लेबल किए गए एंटीबॉडी को एंटीजन + एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स में शामिल किया जाता है, और इस कॉम्प्लेक्स का पता लगाने के लिए, एक सब्सट्रेट (एंजाइम-संवेदनशील पदार्थ) जोड़ा जाता है, जो एंजाइम की कार्रवाई के तहत विघटित होता है, जिससे एंजाइमी प्रतिक्रिया का एक रंगीन उत्पाद बनता है। , प्रकाश सूक्ष्मदर्शी में स्पष्ट रूप से दिखाई देता है।

ऑर्थोफेनिलिनेडियामिन, 5-अमीनोसैलिसिलिक एसिड या बेंज़िडाइन का उपयोग सब्सट्रेट के रूप में किया जाता है। इनमें हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) मिलाया जाता है।

इस विकल्प में वायरल एंटीजन की पहचान के लिए सामग्री हो सकती है: स्मीयर; विभिन्न अंगों के प्रिंट; पैराफिन अनुभाग; कोशिका संवर्धन। इस मामले में, आप प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष दोनों तरीकों का उपयोग कर सकते हैं।

सीधी विधि. एक संयुग्म (एंजाइम के साथ लेबल किए गए पुष्ट वायरस के एंटीबॉडीज) को निश्चित तैयारी पर लगाया जाता है, एक आर्द्र कक्ष में 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है, फिर अनबाउंड संयुग्म को हटाने के लिए तैयारी को खारा से धोया जाता है, सुखाया जाता है हवा में, सब्सट्रेट घोल की कुछ बूंदें डाली जाती हैं, और 5-10 मिनट तक इनक्यूबेट किया जाता है और खारे घोल से धोया जाता है। फिर आसुत जल से कुल्ला करें, और परिणाम एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके देखा जाता है। सकारात्मक मामलों में, यानी परीक्षण सामग्री में एंटीजन की उपस्थिति में, या तो फैला हुआ पीला-भूरा रंग या भूरे-काले दाने दिखाई देते हैं। नियंत्रण तैयारियों में कोई धुंधलापन नहीं पाया गया।

अप्रत्यक्ष विधि. पुष्ट वायरस के लिए विशिष्ट सीरम को निश्चित तैयारी में लगाया जाता है, एक आर्द्र कक्ष में 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है, खारा से धोया जाता है, हवा में सुखाया जाता है और एक एंजाइम-लेबल एंटी-प्रजाति सीरम लगाया जाता है, रखा जाता है 1-6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस। अगली प्रक्रिया प्रत्यक्ष विधि के अनुसार होती है।

एन्ज़ाइम - लिंक्ड इम्यूनोसॉरबेंट एसै जांच(टीएफआईएफए, रेमा - एंजाइम-लेबल एंटीबॉडी प्रतिक्रिया, एलिसा - एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख) में पिछले साल काविषाणु विज्ञान सहित जीव विज्ञान में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। विशेषताविधि यह है कि प्रतिक्रिया घटकों में से एक (एंटीजन या एंटीबॉडी) को एक ठोस समर्थन पर तय किया जाता है। पॉलीस्टाइरीन माइक्रोपैनल, बॉल, स्टिक आदि का उपयोग वाहक के रूप में किया जाता है।

यह विधि एंटीजन का पता लगा सकती है और पहचान सकती है, साथ ही एंटीबॉडी का पता लगा सकती है और रक्त सीरम में उनका टिटर निर्धारित कर सकती है।

विधि के कई रूप हैं. अक्सर, एंटीजन का पता लगाने के लिए प्रत्यक्ष विधि ("सैंडविच" विधि) का उपयोग किया जाता है। ऐसा करने के लिए, ख्यात एंटीजन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी को माइक्रोपैनल के कुओं में तय किया जाता है जिसमें परीक्षण एंटीजन जोड़ा जाता है और 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। फिर माइक्रोपैनल को बफर समाधान से धोया जाता है और एंटीबॉडी को एक के साथ लेबल किया जाता है पोटेटिव एंटीजन में एंजाइम को कुओं में जोड़ा जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 -2 घंटे रखा जाता है, माइक्रोपैनल धो लें, एक सब्सट्रेट समाधान जोड़ें और 5-30 मिनट के लिए छोड़ दें। प्रतिक्रिया को सल्फ्यूरिक एसिड का एक समाधान जोड़कर रोक दिया जाता है और प्रयोगात्मक और नियंत्रण नमूनों के रंग में अंतर या स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग करके दृश्यमान रूप से ध्यान में रखा जाता है। सकारात्मक नमूने पीले से नारंगी-भूरे रंग के हैं।

एंटीबॉडी टिटर का पता लगाना और निर्धारण अप्रत्यक्ष ठोस-चरण विधि द्वारा किया जाता है।

बड़ी नैदानिक ​​​​प्रयोगशालाएँ ठोस-चरण एलिसा करने के लिए पूरी तरह से स्वचालित इकाइयों का उपयोग करती हैं, जो प्रतिदिन 1000 से 4000 नमूनों का विश्लेषण करने की अनुमति देती हैं।

एलिसा के लाभ: उच्च संवेदनशीलता; विशिष्टता; मंचन तकनीक की सरलता; आवश्यक घटकों की न्यूनतम संख्या; किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं; मूल्यांकन दृष्टिगत रूप से किया जा सकता है; स्वचालन की संभावना, जो इसे बड़े पैमाने पर अनुसंधान के लिए उपयोग करने की अनुमति देती है; परीक्षण सीरा को पूर्व-उपचार की आवश्यकता नहीं होती है। यह एक एक्सप्रेस निदान पद्धति है, क्योंकि आपको कुछ ही घंटों में उत्तर मिल सकता है।

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सेलुलर प्रौद्योगिकियों, आणविक जीव विज्ञान, आनुवंशिकी, भौतिकी, रसायन विज्ञान और कई अन्य उच्च-तकनीकी विषयों के विकास के संबंध में, नई उच्च-परिशुद्धता और उच्च-तकनीकी विधियों को रोजमर्रा के अभ्यास में पेश किया जा रहा है। ये अंतःविषय रुझान चिकित्सा ज्ञान के क्षेत्र और जैविक और जैव रासायनिक समस्याओं के संबंधित क्षेत्रों दोनों को प्रभावित करते हैं। पिछले दस वर्षों में, एंजाइम इम्यूनोएसे नामक एक नैदानिक ​​​​प्रयोगशाला निदान पद्धति व्यापक हो गई है और बड़े पैमाने पर अभ्यास में पेश की गई है।

सामान्य तौर पर, 20वीं सदी के शुरुआती 80 के दशक से प्रतिरक्षाविज्ञानी एंजाइमैटिक और रेडियोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं की प्रौद्योगिकियों का व्यापक रूप से टाइपिंग कोशिकाओं, सेल संस्कृतियों और विभिन्न ऊतकों में उपयोग किया गया है। हालाँकि, ये विधियाँ बहुत श्रम-गहन थीं, एकीकृत नहीं थीं, मानकीकृत नहीं थीं, जिससे बड़े पैमाने पर निदान और उपचार उद्देश्यों के लिए उनका उपयोग बाधित हो गया। ऐसी विधियों का उपयोग केवल संकीर्ण, ज्ञान-गहन और अत्यधिक विशिष्ट प्रयोगशालाओं द्वारा किया जाता था।

हालाँकि, प्रौद्योगिकी, सूक्ष्म प्रौद्योगिकी के विकास और विभिन्न बायोपॉलिमर सामग्रियों के उत्पादन के साथ, तैयार एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट डायग्नोस्टिक किट का उत्पादन करना संभव हो गया है जिसका उपयोग सामान्य चिकित्सा संस्थानों की प्रयोगशालाओं द्वारा किया जा सकता है। एलिसा का उपयोग व्यापक रूप से सभी प्रकार के संक्रमणों (क्लैमाइडिया, सिफलिस, साइटोमेगालोवायरस, टॉक्सोप्लाज्मोसिस, हर्पीस इत्यादि) के निदान के लिए किया जाता है, दोनों तीव्र और जीर्ण, साथ ही अव्यक्त रूप जो नैदानिक ​​लक्षणों के बिना होते हैं। इस पद्धति का उपयोग पुरानी बीमारियों को नियंत्रित करने के लिए भी किया जाता है। . आइए यह जानने का प्रयास करें कि यह किस प्रकार की विधि है और इसके अंतर्गत कौन से सिद्धांत हैं?

एंजाइम इम्यूनोएसे के घटक - प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया

जैसा कि नाम से पता चलता है, एंजाइम इम्यूनोएसे में दो अलग-अलग घटक होते हैं - एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और एक एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जैविक अणुओं, कोशिका या सूक्ष्मजीव के तत्वों का बंधन पैदा करती है, जिसका वे वास्तव में पता लगाने की कोशिश कर रहे हैं, और एंजाइम प्रतिक्रिया आपको प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रिया के परिणाम को देखने और मापने की अनुमति देती है। यानी, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एक जटिल तकनीक का हिस्सा है जो वास्तव में वांछित सूक्ष्म जीव का पता लगाती है। और एंजाइम प्रतिक्रिया जटिल तकनीक का वह हिस्सा है जो आपको प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के परिणाम को रूप में अनुवाद करने की अनुमति देती है आँख से दृश्यमान, और नियमित रासायनिक तकनीकों का उपयोग करके माप के लिए सुलभ है। एंजाइम इम्यूनोएसे विधि की इस संरचना के आधार पर हम इसके दोनों भागों का अलग-अलग विश्लेषण करेंगे।

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, यह क्या है? एंटीबॉडी या एंटीजन क्या है?

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया क्या है? एंटीजन क्या है?
सबसे पहले, आइए देखें कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएँ क्या हैं। प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं- ये एक प्रतिरक्षा परिसर के गठन के साथ एक एंटीजन को एक एंटीबॉडी से जोड़ने की विशिष्ट प्रतिक्रियाएं हैं। इसका मतलब क्या है? किसी भी जीव की प्रत्येक कोशिका की सतह पर होते हैं विशेष संरचनाएँजिन्हें कहा जाता है एंटीजन. सामान्यतः एंटीजन ऐसे अणु होते हैं जो किसी कोशिका के बारे में जानकारी रखते हैं (किसी व्यक्ति के बैज पर जानकारी के समान, जो उस व्यक्ति के मूल डेटा को इंगित करता है)।

व्यक्तिगत और प्रजाति प्रतिजन - वे क्या हैं? इन एंटीजन की आवश्यकता क्यों है?

उपलब्ध व्यक्तिगत प्रतिजन, अर्थात्, केवल इस विशेष जीव में निहित है। ये व्यक्तिगत एंटीजन सभी लोगों के लिए अलग-अलग होते हैं; कुछ ऐसे भी होते हैं जो एक-दूसरे के समान होते हैं, लेकिन फिर भी भिन्न होते हैं। प्रकृति में अलग-अलग एंटीजन की दो समान प्रतियां नहीं हैं!

एंटीजन का दूसरा मुख्य प्रकार है प्रजाति प्रतिजन, अर्थात किसी में भी अंतर्निहित विशिष्ट प्रजातिसजीव प्राणी। उदाहरण के लिए, मनुष्यों के पास अपनी प्रजाति का एंटीजन होता है, जो सभी लोगों में समान होता है, चूहों के पास अपनी माउस प्रजाति का एंटीजन होता है, आदि। प्रत्येक कोशिका की सतह पर एक विशिष्ट और व्यक्तिगत एंटीजन आवश्यक रूप से मौजूद होता है।

प्रजाति एंटीजन का उपयोग प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं द्वारा "दोस्त या दुश्मन" को पहचानने के लिए किया जाता है।

एंटीजन पहचान कैसे होती है?

प्रतिरक्षा कोशिका संदिग्ध कोशिका से संपर्क करती है और व्यक्तिगत एंटीजन के आधार पर पहचान करती है। प्रतिरक्षा कोशिका की स्मृति में, यह "रिकॉर्ड" किया जाता है कि "उसका एंटीजन" कैसा दिखता है। इस प्रकार, यदि किसी संदिग्ध कोशिका का एंटीजन "स्वयं एंटीजन" विवरण से मेल खाता है, तो शरीर की अपनी यह कोशिका कोई खतरा पैदा नहीं करती है। फिर प्रतिरक्षा कोशिका "खुल जाती है" और चली जाती है। और यदि एंटीजन "स्वयं" के विवरण से मेल नहीं खाता है, तो प्रतिरक्षा कोशिका इस कोशिका को "विदेशी" के रूप में पहचानती है और इसलिए संभवतः पूरे जीव के लिए खतरनाक है। इस मामले में, प्रतिरक्षा कोशिका "ढीली" नहीं होती, बल्कि खतरनाक वस्तु को नष्ट करना शुरू कर देती है। ऐसी प्रतिरक्षाविज्ञानी पहचान की सटीकता अद्भुत है - 99.97%। व्यावहारिक रूप से कोई ग़लतियाँ नहीं हैं!

एंटीबॉडी, प्रतिरक्षा कॉम्प्लेक्स क्या है?
एंटीबॉडी क्या है?

एंटीबॉडी एक विशेष अणु है जो प्रतिरक्षा कोशिका की सतह पर स्थित होता है। यह एंटीबॉडी है जो संदिग्ध कोशिका के एंटीजन से जुड़ती है। इसके बाद, एंटीबॉडी कोशिका के अंदर सूचना प्रसारित करता है, जहां पहचान होती है, और दो प्रकार के रिटर्न सिग्नल प्राप्त करता है, "स्वयं" या "विदेशी।" "स्वयं" संकेत प्राप्त होने पर, एंटीबॉडी एंटीजन के साथ बंधन को तोड़ देती है और कोशिका को छोड़ देती है।

इम्यून कॉम्प्लेक्स क्या है?
जब सिग्नल "अजनबी" होता है, तो स्थिति अलग तरह से सामने आती है। एंटीबॉडी एंटीजन के साथ संबंध नहीं तोड़ती है, बल्कि, इसके विपरीत, विशिष्ट संकेत भेजकर "सुदृढीकरण" का कारण बनती है। जैविक रूप से, इसका मतलब है कि कोशिका के दूसरे भाग में स्थित अन्य एंटीबॉडी उस स्थान पर जाना शुरू कर देते हैं जहां से खतरे का संकेत आ रहा है और वे अपने और पकड़े गए एंटीजन के बीच एक बंधन भी बनाते हैं। अंत में, एंटीजन चारों ओर से घिरा हुआ और मजबूती से जुड़ा हुआ हो जाता है। इस एंटीजन + एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स को कहा जाता है प्रतिरक्षा जटिल. इसी क्षण से, एंटीजन का उपयोग शुरू हो जाता है। लेकिन अब हमें एंटीजन न्यूट्रलाइजेशन प्रक्रिया के विवरण में कोई दिलचस्पी नहीं है।

एंटीबॉडी के प्रकार (आईजी ऐ, आईजीएम, आईजीजी, आईजी डी, मैं जीई)
एंटीबॉडीज़ प्रोटीन संरचनाएं हैं, जो तदनुसार होती हैं रासायनिक नाम, जिसका प्रयोग एंटीबॉडी शब्द के पर्यायवाची के रूप में किया जाता है। इसलिए, एंटीबॉडीज़ = इम्युनोग्लोबुलिन.

इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी) 5 प्रकार के होते हैं, जिससे जुड़े हुए हैं अलग - अलग प्रकारमानव शरीर के विभिन्न स्थानों में एंटीजन (उदाहरण के लिए, त्वचा, श्लेष्मा झिल्ली, रक्त में, आदि)। यानी एंटीबॉडी में श्रम का विभाजन होता है। इन इम्युनोग्लोबुलिन को लैटिन वर्णमाला के अक्षरों - ए, एम, जी, डी, ई द्वारा बुलाया जाता है और इन्हें इस प्रकार नामित किया जाता है - आईजीए, आईजीएम, आईजीजी, आईजीडी, आईजीई।

निदान में, केवल एक प्रकार के एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, जो पता लगाए जाने वाले सूक्ष्म जीव के लिए सबसे विशिष्ट है। अर्थात्, इस प्रकार के एंटीबॉडी का पता लगाए गए एंटीजन से बंधन हमेशा होता रहता है। आईजीजी और आईजीएम का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है।

यह प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का सिद्धांत (पहचान की अद्वितीय सटीकता और विशिष्टता निर्धारित करता है जैविक वस्तु) एंजाइम इम्यूनोपरख का आधार है। एंटीजन को पहचानने में एंटीबॉडी की उच्च सटीकता के कारण, संपूर्ण एंजाइम इम्यूनोपरख विधि की सटीकता भी उच्चतम है।

एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया

कौन सी प्रतिक्रिया एंजाइमेटिक है? किसी प्रतिक्रिया की एफ़िनिटी, सब्सट्रेट और उत्पाद क्या हैं?
आइए एंजाइम इम्यूनोएसे विधि के कार्य में एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया पर विचार करें।

एन्जाइमी प्रतिक्रिया क्या है?

एक एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया है रासायनिक प्रतिक्रिया, जिसमें एक एंजाइम की क्रिया द्वारा एक पदार्थ दूसरे पदार्थ में परिवर्तित हो जाता है। वह पदार्थ जिस पर एन्जाइम कार्य करता है, कहलाता है सब्सट्रेट. तथा वह पदार्थ जो किसी एन्जाइम की क्रिया के फलस्वरूप प्राप्त होता है, कहलाता है प्रतिक्रिया उत्पाद. इसके अलावा, एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया की ख़ासियत ऐसी है कि एक निश्चित एंजाइम केवल एक निश्चित सब्सट्रेट पर कार्य करता है। किसी एंजाइम के "अपने" सब्सट्रेट को पहचानने के इस गुण को कहा जाता है आत्मीयता.

इस प्रकार, प्रत्येक एंजाइम अपने लिए केवल एक विशिष्ट प्रतिक्रिया करता है। में एंजाइम जैविक दुनियाबहुत सारी ज्ञात और साथ ही एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाएं भी हैं। एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट डायग्नोस्टिक्स में, केवल कुछ एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं का उपयोग किया जाता है - 10 से अधिक नहीं। उसी समय, ऐसी एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं को चुना गया, जिसका उत्पाद रंगीन पदार्थ हैं। एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया के उत्पादों को रंगीन क्यों होना चाहिए? क्योंकि किसी रंगीन घोल से किसी पदार्थ की सांद्रता की गणना करने के लिए एक सरल रासायनिक विधि है - वर्णमिति.

वर्णमिति विधि - सार और सिद्धांत

वर्णमितिसमाधान के रंग घनत्व के माप का उपयोग करता है, और पदार्थ की एकाग्रता की गणना रंग घनत्व से की जाती है। इस मामले में, एक विशेष उपकरण - एक वर्णमापी समाधान के रंग घनत्व को मापता है। वर्णमिति में, किसी पदार्थ की सांद्रता पर रंग घनत्व की निर्भरता के लिए दो संभावित विकल्प हैं - सीधे आनुपातिक निर्भरता या व्युत्क्रम आनुपातिक निर्भरता। सीधे आनुपातिक संबंध के साथ, पदार्थ की सांद्रता जितनी अधिक होगी, घोल का रंग घनत्व उतना ही अधिक तीव्र होगा। व्युत्क्रमानुपाती संबंध के साथ, पदार्थ की सांद्रता जितनी अधिक होगी, घोल का रंग घनत्व उतना ही कम होगा। तकनीकी रूप से, यह इस प्रकार होता है: किसी पदार्थ की ज्ञात सांद्रता वाले कई समाधान लिए जाते हैं, इन समाधानों का घनत्व मापा जाता है, और रंग घनत्व पर एकाग्रता की निर्भरता का एक ग्राफ बनाया जाता है ( अंशांकन चार्ट).

इसके बाद, घोल का रंग घनत्व मापा जाता है, जिसकी सांद्रता निर्धारित की जाती है, और अंशांकन ग्राफ से सांद्रता मान पाया जाता है, स्तर के अनुरूपसमाधान का रंग घनत्व मापा जाता है। आधुनिक स्वचालित कलरमीटर में, अंशांकन केवल एक बार किया जाता है, फिर डिवाइस स्वयं एक अंशांकन वक्र बनाता है, जो डिवाइस की मेमोरी में रहता है, और माप स्वचालित रूप से होता है।

एंजाइम इम्यूनोएसे में निम्नलिखित एंजाइमों का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है: पेरोक्सीडेज, क्षारीय फॉस्फेट, एविडिन।

एंजाइम इम्यूनोएसे में प्रतिरक्षाविज्ञानी और एंजाइमैटिक प्रतिक्रियाएं कैसे संयुक्त होती हैं? अब हम एंजाइम इम्यूनोएसे पर ही विचार करने के लिए आगे बढ़ेंगे। इसमें कौन से चरण शामिल हैं और इन प्रतिक्रियाओं के दौरान क्या होता है? एंजाइम इम्यूनोएसे किया जा सकता है प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष.

प्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोपरख - कार्यान्वयन के चरण

प्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोपरख में, पता लगाए गए एंटीजन के प्रति एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, जिसे एक विशिष्ट लेबल के साथ जोड़ा जाता है। यह विशिष्ट लेबल एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया का सब्सट्रेट है।

कुएं की सतह पर एंटीजन का जुड़ाव और एंटीबॉडी के साथ एंटीजन का संयोजन

प्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोपरख कैसे की जाती है? जैविक सामग्री ली जाती है (रक्त, श्लेष्म झिल्ली से स्क्रैपिंग, स्मीयर) और विशेष छिद्रों में रखा जाता है। जैविक सामग्री को 15-30 मिनट के लिए कुओं में छोड़ दिया जाता है ताकि एंटीजन कुओं की सतह पर चिपक सकें। इसके बाद, पता लगाए गए एंटीजन के प्रति एंटीबॉडी को इन कुओं में जोड़ा जाता है। इसका मतलब यह है कि जब एंटीजन का पता लगाया जाता है, उदाहरण के लिए, सिफलिस, सिफलिस एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी जोड़े जाते हैं। ये एंटीबॉडी औद्योगिक रूप से प्राप्त की जाती हैं, और प्रयोगशालाएं तैयार किट खरीदती हैं। परीक्षण सामग्री और एंटीबॉडी के इस मिश्रण को कुछ समय (30 मिनट से 4-5 घंटे तक) के लिए छोड़ दिया जाता है ताकि एंटीबॉडी "अपने" एंटीजन को ढूंढ सकें और उनसे संपर्क कर सकें। जैविक नमूने में जितने अधिक एंटीजन होंगे, उतनी ही अधिक एंटीबॉडी उनसे जुड़ेंगी।

"अतिरिक्त" एंटीबॉडी को हटाना

जैसा कि संकेत दिया गया है, एंटीबॉडीज़ भी एक विशिष्ट लेबल से जुड़े होते हैं। चूंकि एंटीबॉडीज़ को अधिक मात्रा में जोड़ा जाता है, इसलिए उनमें से सभी एंटीजन से नहीं बंधेंगे, और यदि नमूने में कोई एंटीजन नहीं है, तो तदनुसार, एक भी एंटीबॉडी एंटीजन से नहीं बंधेगा। वांछित प्रतिजन. "अतिरिक्त" एंटीबॉडी को हटाने के लिए, कुओं से सामग्री को आसानी से बाहर निकाल दिया जाता है। इसके परिणामस्वरूप, सभी "अतिरिक्त" एंटीबॉडी हटा दिए जाते हैं, और जो एंटीजन से बंधे होते हैं वे बने रहते हैं, क्योंकि एंटीजन कुओं की सतह पर "चिपके" होते हैं। कुओं को एक विशेष समाधान के साथ कई बार धोया जाता है, जो आपको सभी "अतिरिक्त" एंटीबॉडी को धोने की अनुमति देता है।

इसके बाद, दूसरा चरण शुरू होता है - एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया। धुले हुए कुओं में एंजाइम वाला घोल डाला जाता है और 30-60 मिनट के लिए छोड़ दिया जाता है। इस एंजाइम में उस पदार्थ (विशिष्ट लेबल) के प्रति आकर्षण होता है जिससे एंटीबॉडी बंधे होते हैं। एंजाइम एक प्रतिक्रिया करता है जो इस विशिष्ट चिह्न (सब्सट्रेट) को एक रंगीन पदार्थ (उत्पाद) में परिवर्तित करता है। फिर वर्णमिति का उपयोग करके इस रंगीन पदार्थ की सांद्रता ज्ञात की जाती है। चूंकि यह विशिष्ट लेबल एंटीबॉडी से जुड़ा है, इसका मतलब है कि रंगीन प्रतिक्रिया उत्पाद की एकाग्रता एंटीबॉडी की एकाग्रता के बराबर है। और एंटीबॉडी की सांद्रता एंटीजन की सांद्रता के बराबर होती है। इस प्रकार, विश्लेषण के परिणामस्वरूप, हमें पता लगाए गए सूक्ष्म जीव या हार्मोन की एकाग्रता के बारे में उत्तर प्राप्त होता है।

प्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोएसे ठीक इसी प्रकार काम करता है। हालाँकि, आज अप्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोएसे का अधिक उपयोग किया जाता है, क्योंकि अप्रत्यक्ष की संवेदनशीलता और सटीकता प्रत्यक्ष की तुलना में अधिक है। तो, चलिए अप्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोएसे की ओर बढ़ते हैं।

अप्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोपरख - कार्यान्वयन के चरण

अप्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोपरख में दो चरण होते हैं। पहले चरण के दौरान, पहचाने गए एंटीजन के लिए बिना लेबल वाले एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, और दूसरे चरण में, पहले बिना लेबल वाले एंटीबॉडी के लिए लेबल वाले एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। अर्थात्, यह किसी एंटीबॉडी का किसी एंटीजन से सीधा बंधन नहीं है, बल्कि दोहरा नियंत्रण है: एंटीबॉडी का एक एंटीजन से बंधन, उसके बाद दूसरे एंटीबॉडी का एंटीबॉडी + एंटीजन कॉम्प्लेक्स से बंधन। एक नियम के रूप में, पहले चरण के लिए एंटीबॉडी चूहे हैं, और दूसरे के लिए - बकरी।

कुएं की सतह पर एंटीजन का स्थिरीकरण और एंटीजन को बिना लेबल वाले एंटीबॉडी से बांधना
सीधे एंजाइम इम्यूनोएसे की तरह, जैविक सामग्री एकत्र की जाती है - रक्त, स्क्रैपिंग, स्मीयर। अध्ययन के तहत जैविक सामग्री को कुओं में पेश किया जाता है और एंटीजन को कुओं की सतह पर चिपकने के लिए 15-30 मिनट के लिए छोड़ दिया जाता है। फिर एंटीजन में बिना लेबल वाले एंटीबॉडी को कुओं में जोड़ा जाता है और कुछ समय (1-5 घंटे) के लिए छोड़ दिया जाता है ताकि एंटीबॉडी "अपने" एंटीजन से बंध जाएं और एक प्रतिरक्षा कॉम्प्लेक्स बनाएं ( पहला कदम). उसके बाद, कुओं की सामग्री को बाहर निकालकर "अतिरिक्त" अनबाउंड एंटीबॉडी को हटा दिया जाता है। सभी अनबाउंड एंटीबॉडीज को पूरी तरह हटाने के लिए एक विशेष घोल से धोएं।

लेबल किए गए एंटीबॉडी को एंटीजन + अनलेबल एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स से बांधना
जिसके बाद वे दूसरे लेबल वाले एंटीबॉडी लेते हैं, उन्हें कुओं में डालते हैं और फिर से थोड़ी देर के लिए छोड़ देते हैं - 15-30 मिनट ( दूसरा चरण). इस समय के दौरान, लेबल किए गए एंटीबॉडी पहले - बिना लेबल वाले - से जुड़ते हैं और एक जटिल - एंटीबॉडी + एंटीबॉडी + एंटीजन बनाते हैं। हालाँकि, लेबल किए गए और बिना लेबल वाले दोनों एंटीबॉडी कुओं में अधिक मात्रा में जोड़े जाते हैं। इसलिए, पहले से लेबल किए गए "अतिरिक्त" एंटीबॉडी को फिर से हटाना आवश्यक है जो गैर-लेबल वाले एंटीबॉडी से बंधे नहीं हैं। ऐसा करने के लिए, कुओं की सामग्री को बाहर निकालने और एक विशेष समाधान से धोने की प्रक्रिया को दोहराएं।

एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया - एक रंगीन यौगिक का निर्माण
उसके बाद, एक एंजाइम जोड़ा जाता है जो "लेबल" को रंगीन पदार्थ में परिवर्तित करने की प्रतिक्रिया करता है। रंग 5-30 मिनट के भीतर विकसित हो जाता है। फिर वर्णमिति की जाती है और रंगीन पदार्थ की सांद्रता की गणना की जाती है। चूँकि रंगीन पदार्थ की सांद्रता लेबल वाले एंटीबॉडी की सांद्रता के बराबर होती है, और लेबल किए गए एंटीबॉडी की सांद्रता बिना लेबल वाले एंटीबॉडी की सांद्रता के बराबर होती है, जो बदले में एंटीजन की सांद्रता के बराबर होती है। इस प्रकार, हम ज्ञात एंटीजन की सांद्रता प्राप्त करते हैं।
दो प्रकार के एंटीबॉडी के उपयोग के रूप में इस दोहरे नियंत्रण ने एंजाइम इम्यूनोएसे विधि की संवेदनशीलता और विशिष्टता को बढ़ाना संभव बना दिया। विश्लेषण के समय को लंबा करने और अतिरिक्त चरणों को शामिल करने के बावजूद, इन नुकसानों की भरपाई परिणाम की सटीकता से की जाती है। यही कारण है कि वर्तमान में अधिकांश एंजाइम इम्यूनोपरख विधियां अप्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोपरख हैं।

एंजाइम इम्यूनोएसे द्वारा किन रोगों का पता लगाया जाता है?

आइए इस बात पर विचार करें कि एंजाइम इम्यूनोएसे द्वारा किन बीमारियों और कौन से जैविक रूप से सक्रिय पदार्थों का पता लगाया जाता है। एंजाइम इम्यूनोएसे द्वारा पता लगाए गए पदार्थ तालिका में प्रस्तुत किए गए हैं।

थायराइड रोग के हार्मोन और मार्कर	थायराइड पेरोक्सीडेज (टीपीओ)
	थायरोग्लोबुलिन (टीजी)
	थायराइड-उत्तेजक हार्मोन (टीएसएच)
	थायरोक्सिन (T4)
	ट्राईआयोडोथायरोनिन (T3)
	मुफ़्त थायरोक्सिन (T4)
	मुफ़्त ट्राईआयोडोथायरोनिन (T3)
प्रजनन क्रिया का निदान	ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच)
	कूप उत्तेजक हार्मोन (FSH)
	प्रोलैक्टिन
	प्रोजेस्टेरोन
	एस्ट्राडियोल
	टेस्टोस्टेरोन
	कोर्टिसोल
	स्टेरॉयड बाइंडिंग ग्लोब्युलिन (एसबीजी)
	अल्फाफेटोप्रोटीन (एएफपी)
ट्यूमर मार्कर्स	कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (सीजी)
	प्रोस्टेट-विशिष्ट एंटीजन (पीएसए)
	एसए - 125
	एसए - 19.9
	साइफ्रा-21-1
	एम - 12 (एसए - 15.3)
	एमयूसी - 1 (एम - 22)
	MUC1 (एम - 20)
	एल्वोमुसिन
	के - श्रृंखला
	एल - श्रृंखला
	ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNFα)
	γ - इंटरफेरॉन
	कार्सिनोएम्ब्रायोनिक एंटीजन (सीईए)
संक्रामक रोगों का निदान